Nel luogo dove sorge l'attuale Fortezza Medicea senese, si ergeva precedentemente un forte (chiamato "Cittadella") fatto ivi edificare dall'imperatore, nonché re di Spagna, Carlo V nel 1548, nel tentativo di assoggettare la Repubblica Senese e farne una piazzaforte imperiale nell'Italia centrale. La collocazione del forte, piuttosto che rivolta alle minacce esterne, fu infatti decisa nell'intento di controllare la città. Nell'intraprenderne la costruzione, sotto il pretesto di prevenire contese tra le fazioni cittadine, l'ambasciatore Diego Hurtado de Mendoza[1] mise in atto ripetute provocazioni, come la capitozzatura delle tantissime antiche torri signorili di cui la città si fregiava, per reperire materiali da costruzione.

Il 26 luglio 1552, tuttavia, i senesi insorsero contro gli spagnoli, assediandoli nella fortezza non ancora completata, scacciandoli dalla città e iniziando la demolizione dell'odiato simbolo dell'asservimento[1].

Durante la guerra che ne seguì i senesi furono costretti a riattivare la fortezza, che fronteggiava il campo imperiale, da cui le batterie di artiglieria battevano la città. Circa tre anni dopo, il 21 aprile 1555, Siena, cinta d'assedio da oltre un anno dalle truppe spagnole e medicee, si arrese stremata ai nemici. La Repubblica senese, sostenuta dagli alleati francesi, continuava nel frattempo, riparata in Montalcino, una resistenza a oltranza. La Pace di Cateau-Cambrésis (2-3 aprile 1559) tra la Francia e gli Asburgo condusse la Repubblica di Siena, rimasta priva di alleati, alla resa definitiva; lo stato di Siena fu quindi assegnato, in virtù delle forti spese sostenute, al duca Cosimo dei Medici.

Onde soffocare qualsiasi tentativo di ulteriore ribellione da parte dei senesi, Cosimo I ordinò la ricostruzione dell'attuale Fortezza Medicea sullo stesso luogo ove sorgeva la cittadella spagnola[1]. L'edificio fu progettato dall'architetto urbinate Baldassarre Lanci e i lavori ebbero inizio nel 1561[1]. Due anni dopo, nel 1563[2], la fortezza fu completata.

La Fortezza Medicea senese fu smilitarizzata solo sul finire del XVIII secolo, dal granduca Pietro Leopoldo[3]. Da quel momento, lo spiazzo antistante, la Lizza, dove si svolgevano le esercitazioni militari, fu convertito in giardino e entrò a far parte dei luoghi della vita pubblica senese.

Nel 1937, a seguito di lavori di restauro, anche l'interno della fortezza, fino ad allora usato come caserma, fu trasformato in giardino pubblico, come è tutt'oggi[3][1]. Il forte senese ospita, altresì, un'enoteca, mostre, nonché manifestazioni di vario tipo, tra cui i concerti organizzati dall'associazione Siena Jazz, che ha nella fortezza la propria sede operativa[3][1].