L'incendio dell'Alcázar di Madrid, del 1734, distrusse le collezioni americane che i re di Spagna avevano accumulato, compresi i pezzi offerti alla Corona dai conquistadores.[1] Si salvarono un ridotto numero di pezzi presenti in altri luoghi, come i codici e le corone di piume conservate nel Monastero dell'Escorial e alcuni codici messicani conservati nella Reale Biblioteca Pubblica, oggi Biblioteca Nazionale di Spagna. A causa di questo evento, le collezioni più antiche attualmente nel Museo sono quelle provenienti dal Reale Gabinetto di storia naturale, costituito da Carlo III nel 1771 a partire della donazione della collezione che Pedro Franco Dávila aveva riunito durante il suo soggiorno di più di quattordici anni a Parigi. Con il fine di aumentare i fondi museali, questa istituzione ordinò ai territori dell'America spagnola l'invio in patria di opere rappresentative, comprendenti pezzi provenienti dai primi scavi archeologici compiuti nel nuovo continente. Vennero anche incorporati al Reale Gabinetto, dei materiali etnografici ottenuti nelle spedizioni scientifiche ai tempi della scoperta.

Nel 1868 le collezioni di antichità, arte e etnografía del Reale Gabinetto (che nel 1815 erano state dissolte e integrate, insieme ad altri istituti, nel nuovo Museo Reale di scienze naturali di Madrid, antenato diretto dell'odierno Museo Nazionale di scienze naturali) sono state trasferite al Museo Archeologico Nazionale, creato l'anno prima, oltre a quelle provenienti dal Museo delle medaglie e antichità della Biblioteca Nazionale, che aveva alcuni pezzi americani, della Scuola superiore di diplomazia e della Reale accademia della storia.[2][3][4] Dal Museo archeologico, a sua volta, vennero separate quelle di origine americana (fino ad allora nella sezione IV o di etnografía) con il Decreto di avviamento del Museo delle Americhe, del 19 aprile 1941, il quale stabiliva che «Il fondo iniziale verrà costituito dalle collezioni di etnografia e archeologia americana esistenti nel Museo archeologico nazionale, con i suoi libri, vetrine e arredo».[5] Anche se il decreto di fondazione non le menzionava, vennero passate al nuovo museo le collezioni di Filippine e Oceania, oltre ad una piccola collezione africana, compresi pezzi provenienti dai luoghi senza relazione alcuna con le esplorazioni e conquiste ultramarine spagnole, come il gruppo di circa cento oggetti sami che era stato donato al museo nel 1896 dall'ingegnere svedese Åke Sjögren.[6]

Creato il nuovo museo, la collezione venne installata provvisoriamente nell'ala sinistra della pianta principale del palazzo, con inaugurazione il 13 luglio 1944. Il museo era costituito da undici sale, sette dedicate ai fondi precolombiani e le altre quattro a quelli coloniali.[7] Nel 1962 iniziò il trasferimento alla sua postazione definitiva, inaugurata ufficialmente tre anni dopo, il 17 luglio 1965. Il Museo è rimasto chiuso tra il 1981 e 1994 per lavori di ristrutturazione.

Oggi è qualificato Bene di interesse culturale con categoria di monumento in virtù del Decreto 474/1962, del 1º marzo (BOE del 9 marzo), mediante il quale determinati musei sono stati dichiarati monumenti storico-artistici.[8]