El museu es va fundar el 1867 per Reial Decret d'Isabel II. La seva creació va estar motivada per la necessitat de disposar d'un museu on, igual que als restants països europeus, es poguessin conservar, classificar i exposar els materials arqueològics, etnogràfics, d'arts decoratives i numismàtiques que havien reunit els monarques espanyols a la Reial Biblioteca, al Reial Gabinet d'Història Natural i en altres institucions. El 1941 els seus fons d'arqueologia americana es van separar del Museu per passar a integrar el nou Museu d'Amèrica.

El va inaugurar el 9 de juliol de 1871 el rei Amadeu I de Savoia, sota la direcció de Ventura Ruiz Aguilera, cobrint aleshores quatre seccions:[1]

Temps primitius, amb 2703 objectes. Edat Mitjana, amb 3033 objectes. Numismàtica, amb 103 096 monedes d'or, plata, bronze i plom. Etnografia, amb 3500 objectes procedents de l'Àsia, Àfrica, Amèrica i Oceania.

Al començament de la Guerra Civil espanyola el Museu va patir el robatori de la seva col·lecció de monedes d'or, així com de l'anomenat Tresor dels Quimbayas. Les monedes van passar a engruixir al nomenat Tresor del iot Vita, traslladat a Mèxic al terme de la contesa, i del qual es va apropiar el dirigent socialista Indalecio Prieto Tuero. El destí de les monedes mai no es va aclarir, encara que la seva bona part sembla que va ser comprada per la Hispanic Society of America, la col·lecció completa de la qual va ser subhastada el 2011 i part portada de tornada a Espanya per Subhastes Vico.6 Per sort, el Tresor dels Quimbayas va ser localitzat a Ginebra després de la guerra i va tornar a Espanya. Per Decret de 19 d'abril de 1941 els fons d'art, arqueologia i etnografia americans es van separar del Museu per integrar el nou Museu d'Amèrica a Madrid.