Історія Уффіці починається в липні 1559 р., коли правитель Флоренції Козімо I Медічі замислив об'єднати всі адміністративні служби міста в загальному просторому палаці. Для реалізації проєкту був запрошений майстер Джорджо Вазарі, який і почав роботу в 1560 р. Для будівництва палацу було звільнено велику ділянку між площею П'яцца-делла-Сеньйорія і річкою Арно шляхом придбання усіх житлових будівель, котрі там були розташовані.

До нового комплексу увійшла стародавня церква Сан П'єро Скераджо, від якої досі збереглись сліди зовні в абсиді зі сторони вулиці віа делла Нінна і в самій будівлі.

1565 року будівництво було майже завершене, включаючи довгий «коридор» Вазарі, який перетинаючи річку Арно по мосту Понте Веккіо, з'єднує Уффіці з Палаццо Пітті і пішохідну естакаду, що веде з віа Нінна в Палаццо Веккіо.

Вписуючи побудований у стилі XVI ст. комплекс Уффіці у середньовічний історичний центр Флоренції, Вазарі намагався не порушити гармонії міської структури тринадцятого сторіччя, спрямовуючись, перш за все, на створення сценічного ефекту масивного Палацу Веккіо. Наступник Козімо, Франческо I, оборонець науки і мистецтв, вирішив перебудувати лоджію, що вінчає будівлю, для створення приміщень під свої колекції предметів мистецтва, зброї, наукових знахідок, лабораторій.

Роботи з перебудови комплексу були доручені наступнику Вазарі архітектору Бернардо Тіманте Буонталенті (1536—1608) в 1580 році (Вазарі помер в 1574 році). В 1586 році роботи з перебудови були завершені і з цього часу в нових приміщеннях комплексу Уффіці були зібрані всі твори, які раніше зберігались в Палаццо Веккіо і Палаццо Медічі, що належали Козімо старшому, Лоренцо Медічі і батьку Франческо, Козімо I.

Протягом століть, завдяки послідовникам Франческо I, галерея поповнювалась шедеврами мистецтва. Один з них — Великий Герцог Пьєтро Леопольдо — зібрав в одне ціле всі твори власності Медічі, які ще були розпорошені по маєткам Риму і Флоренції. Саме йому належить заслуга в тому, що він почав упорядковувати галерею за сучасними музейними критеріями і відкрив її широкій публіці.