Die Kirche wurde zwischen 1573 und 1578 von den Maltesern errichtet, in Auftrag gegeben von Großmeister Jean de la Cassière als repräsentative Klosterkirche an der Ordenszentrale. Entworfen wurde sie vom maltesischen Militärarchitekten Gerolamo Cassar, der auch viele andere Gebäude in Valletta konzipiert hat. Während der Bau nur vier Jahre dauerte, benötigte die vollständige Ausstattung des Innenraums über 100 Jahre. 1820 erhob Papst Pius VII. die Kirche zur Ko-Kathedrale, um ihre Bedeutung für Land und Stadt auch nach der Vertreibung der Malteserritter durch Napoleon im Jahre 1798 zu unterstreichen; der eigentliche Bischofssitz befindet sich in Mdina. Sie steht unter dem Patrozinium von Johannes dem Täufer, Schutzpatron des Malteserordens.

Seit den 2010er Jahren wird das Äußere umfassend saniert.