ทางหลวงสหรัฐหมายเลข 66 หรือ รูต 66 (อังกฤษ: U.S. Route 66 หรือ Route 66) เป็นทางหลวงเส้นหนึ่งในอดีตของสหรัฐอเมริกา ถือเป็นทางหลวงสายแรก ๆ ของรัฐบาลกลาง ก่อตั้งขึ้นเมื่อ 11 พฤศจิกายน ค.ศ. 1926 (พ.ศ. 2469) แต่การติดตั้งป้ายทางหลวงได้ทำในปีถัดมา เส้นทางในสมัยเริ่มแรก เริ่มต้นที่เมืองชิคาโก รัฐอิลลินอย ผ่านรัฐมิสซูรี แคนซัส โอคลาโฮมา เท็กซัส นิวเม็กซิโก แอริโซนา และมาสิ้นสุดที่เมทองงลอสแอนเจลิส รัฐแคลิฟอร์เนีย รวมระยะทางทั้งสิ้น 3,940 กิโลเมตร หรือ 2,448 ไมล์

รูต 66 มีการปรับปรุงและปรับเปลี่ยนเส้นทางหลายครั้ง เช่นเลื่อนจุดสิ้นสุดจากกลางเมืองลอสแอนเจลิส มายังแซนตามอนิกา รูต 66 ไม่ได้สิ้นสุดที่ชายฝั่งมหาสมุทรแปซิฟิกอย่างที่เข้าใจโดยทั่วไป

รูต 66 เป็นเส้นทางหลักของการอพยพจากฝั่งตะวันออกไปยังด้านตะวันตกของสหรัฐอเมริกา โดยเฉพาะปัญหาภัยแล้งจากพายุทรายช่วงคริสต์ทศวรรษที่ 1930 ทำให้ชุมชนที่ตั้งอยู่ในแนวทางหลวงเจริญขึ้นมา

รูต 66 ถูกยกเลิกจากระบบทางหลวงอเมริกาเมื่อวันที่ 27 มิถุนายน ค.ศ. 1985 (พ.ศ. 2528) หลังจากที่ความสำคัญของเส้นทางดังกล่าวหมดไป บางส่วนของเส้นทางเดิมมีการกำหนดให้เป็นเส้นทางชมวิว (National Scenic Byway) ที่ใช้ชื่อว่า Historic Route 66 (แปลว่าเส้นทางประวัติศาสตร์สาย 66) ซึ่งถนนได้แบ่งออกเป็นหลายช่วงและแทนที่ด้วยระบบทางหลวงอินเตอร์สเตต จากตะวันออกไปตะวันตกแบ่งเป็น อินเตอร์สเตต 55 แทนที่ถนนเส้นนี้ช่วงชิคาโกถึงเซนต์หลุยส์ อินเตอร์สเตต 44 แทนที่ถนนนี้ต่อจนถึงโอคลาโฮมาซิตี อินเตอร์สเตต 40 แทนที่ถนนต่อจนถึงบาร์สโตว์ รัฐแคลิฟอร์เนีย และที่เหลือเป็นส่วนสั้นแทนด้วยอินเตอร์สเตต 15 อินเตอร์สเตต 210 รูต 2 และอินเตอร์สเตต 10 ถึงแซนตามอนิกา

ทางหลวงเส้นนี้มีชื่ออื่น เช่น The Main Street of America, The Mother Road และ Will Rogers Highway