Joannici po przybyciu w 1530 na Maltę obrali na swoją siedzibę Birgu położone nad zatoką Wielki Port. Choć miasto to posiadało zamek (Castle Sant Angelo), nie było w przypadku ataku z lądu dogodnym miejscem do obrony. Górujące nad nim półwyspy Sciberras i Isola stanowiły doskonałe miejsce do prowadzenia ostrzału artyleryjskiego. Jednak joannici, myśląc o Malcie tylko jako o tymczasowej bazie, początkowo ograniczyli prace fortyfikacyjne do umocnienia i rozbudowania zamku w Birgu oraz wzmocnienia murów dotychczasowej stolicy wyspy Mdiny. Dalsze prace, mające uniemożliwić zajęcie półwyspów Sciberras i Isola, rozpoczął dopiero wielki mistrz Juan de Homedes budując tam w 1552 dwa forty – na Sciberras Fort św. Elma, a na Isola Fort św. Michała.

W 1557 roku Jean Parisot de la Valette po objęciu urzędu wielkiego mistrza postanowił wzmocnić obronę na Sciberras, wznosząc umocnienia wokół całego półwyspu i budując na nim miasto. Jednak ze względu na brak funduszy i atak wojsk tureckich w 1565 (Wielkie oblężenie), prace te rozpoczęto dopiero w 1566. Kamień węgielny pod budowę miasta, nazwanego na cześć jego założyciela Valletta, został położony 28 marca 1566.

Projekt miasta stworzył, przysłany przez papieża Piusa IV, włoski architekt, uczeń Michała Anioła, Francesco Laparelli. Układ ulic został oparty na planie hippodamejskim, ulice przecinają się ze sobą pod kątem prostym. Całe miasto zostało otoczone szeregiem umocnień, oraz dodatkowo od strony lądu fosą. Ze względu na wysokie koszty i brak czasu (obawiano się ponownego ataku Turków) nie zniwelowano półwyspu, w związku z czym część ulic została zastąpiona schodami. Miały one jednak niskie i długie stopnie, co umożliwiało poruszanie się po nich rycerzom konno, bądź w ciężkich zbrojach.

Pierwszym budynkiem Valletty był kościół Matki Bożej Zwycięskiej, w którym w 1568 pochowany został Jean Parisot de Valette (później grób przeniesiono do konkatedry św. Jana). W 1569 Laparelli po opracowaniu planów dalszej rozbudowy miasta opuścił wyspę, zaś dalszymi pracami zajął się Maltańczyk Girolamo Cassar.

W 1571, choć auberges (siedziby rycerzy poszczególnych prowincji zakonu) nie były jeszcze ukończone, wielki mistrz Pietro del Monte oficjalnie przeniósł siedzibę zakonu z Birgu do Valletty. W ciągu następnych lat Valletta z placu budowy zaczęła przeradzać się w prawdziwe miasto, skończono budowę siedmiu auberges (do dnia dzisiejszego zachowało się tylko pięć), wzniesiono Pałac Wielkich Mistrzów, konkatedrę św. Jana oraz szereg innych budynków. Nie udało się jednak wprowadzić, zaleconego przez papieża, podziału miasta na dwie części, z których jedną mieli zamieszkiwać wyłącznie członkowie zakonu.

W 1575 otwarty został szpital Sacra Infermeria, którego główna sala, o długości 56 m pozostaje jedną z największych w Europie. Dziś w odbudowanym po zniszczeniach, jakich doznał podczas II wojny światowej, budynku szpitala znajduje się centrum konferencyjne oraz Teatr Republiki.

W 1731 wielki mistrz Antonio Manoel de Vilhena wybudował Teatr Manoela (dziś trzeci najstarszy teatr na świecie).

W 1796 powstała Biblioteka Narodowa, w której zbiorach umieszczone zostało m.in. kilkadziesiąt tysięcy tomów będących własnością zakonu. Z powodu ataku i zajęcia Malty przez wojska francuskie w 1798 biblioteka otwarta została dopiero w 1812 roku.