Het Palazzo degli Uffizi werd ontworpen door architect Giorgio Vasari en was in eerste instantie bedoeld als een reeks overheidskantoren voor de magistraten van Florence. De bouw van deze kantoren (gli uffizi) vond plaats in opdracht van Granduca Francisco de’ Medici, zoon van Cosimo I de' Medici. De Uffizi werden tussen 1560 en 1581 relatief snel gebouwd.

Francisco richtte op de bovenste verdieping van het gebouw een galerij in. De collectie werd daarna steeds verder verrijkt door leden van de De’ Medici familie. In 1743 werden de ‘kantoren’, samen met de De’ Medici-kunstcollectie, aan de stad nagelaten door Anna Maria Luisa, de zuster van de laatste De’ Medici-groothertog: Gian Gastone. Zij was de laatste erfgenaam van de De’ Medici familie. De groothertogen van het gebied Lorraine volgden de De’ Medici familie op en herorganiseerden en vergrootten de collectie. Uiteindelijk kwam de galerij in bezit van de Italiaanse staat.

Het gebouw is U-vormig. De museumzalen bevinden zich op de bovenste verdieping.

In 1993 werd een deel van het paleis verwoest door een autobom, waardoor ook enkele schilderijen werden vernietigd en enkele andere zwaar beschadigd. Vijf mensen kwamen bij de aanslag om. Wie de daders zijn is nog steeds onduidelijk, al wordt wel vaak de maffia genoemd.

Vanwege het grote aantal schilderijen dat nog in het depot stond, werd de oorspronkelijke 8000 m² expositieruimte in 2006 uitgebreid tot bijna 13.000 m².

De Galleria degli Uffizi is een van de belangrijkste bezienswaardigheden in Florence. Tijdens de zomermaanden zijn er vaak lange rijen voor de ingang.