Guanajuato er en by og hovedstad i den meksikanske delstaten Guanajuato, 370 km nordvest for Mexico by, i en høyde av 1956 meter. Byen er viktig for utvinning av sølv og gull. I tidlige tider ble området kalt for Mo-o-ti som betyr noe slikt som «metallstedet». Guanajuato ble grunnlagt som en landsby i 1554 men fikk bystatus i 1741. Navnet kommer fra quanax huato, som betyr «froskeåsen» på språket purépecha. I 1988 ble det historiske Guanajuato og nærliggende områder med i UNESCOs liste over verdens kultur- og naturarvsteder. I 2003 bodde det rundt regnet 78 000 innbyggere her.

Byen ble opprinnelig grunnlagt over en elv som fløt i tunneler under byen. Etter mange oversvømmelser i dette tunnelanlegget ble elva ledet inn i underjordiske huler ved midten av det 20. århundret. Tunnelene ble så utstyrt med belysning og brolagt for biltrafikk. Dette underjordiske trafikkanlegget tar nå unna det meste av biltrafikken i det historiske sentrum, og er et karaktertrekk ved byen.

Byen spilte en viktig rolle i Mexicos uavhengighetskamp som hovedstad i opprørsdelstaten Guanajuato. Statuen av El Pípila og bygningen Alhóndiga de Granaditas, et kornlager som ble brukt som fengsel, er et minne fra denne tida.

I katakombene vest for sentrum finner man den kjente kirkegården med de naturlige mumiene. Omtrent et av hundre lik som blir gravlagt her, mumifiseres naturlig. Sent på 1800-tallet ble det innført festeavgift på gravene, noe de fattigste ikke kunne betale. Dermed ble deres slektninger gravd opp og plassert til offentlig skue i et eget museum. Guanajuatos mumiemuseum stiller ennå ut mumier, i 1984 ble to barnemumier stilt ut da slektningene ikke betalte festeavgifta. I dag stilles 111 mumifiserte lik ut, noe som sies å gi et betraktelig bidrag til kommunekassa.

Byen har også en av de største institusjonene i Mexico for matematisk forskning, CIMAT.

Hver oktober finner Festival Internacional Cervantino sted i Guanajuato, en internasjonal kulturfestival med navn etter Miguel de Cervantes. Festivalen er en av de mest populære i Mexico, og også kunstnere og tilskuere fra utlandet lokkes til byen.