Tra le prime popolazioni native dell'area vi erano i Cicimechi ed i Purhépecha[1], dei quali soprattutto i primi, particolarmente bellicosi, opposero una dura resistenza ai conquistadores. Il nome conosciuto più antico dell'area, Mo-o'ti, significa "luogo di metalli". In seguito, fu chiamata Paxtitlán dagli Aztechi con il significato di "luogo di paglia". Il nome attuale "Guanajuato" viene dalla parola tarasca (P'urhépecha) Quanax-juato, che significa "posto delle rane". L'attività mineraria a Guanajuato iniziò ben prima dell'arrivo degli spagnoli, infatti nel tardo periodo preispanico, gli Aztechi già estraevano in quest'area metalli preziosi per la realizzazione degli oggetti ornamentali della loro élite politica e religiosa.

Guanajuato venne fondata nel 1554 e divenne città nel 1741. Si trova su una delle più ricche miniere d'argento del Messico ed è nota per le eccezionali architetture dell'era coloniale spagnola.

La città venne originariamente costruita sopra al fiume Guanajuato, che fluiva nelle gallerie sotto al paese. Dopo anni passati a ricostruire edifici invasi dalle inondazioni, a metà del XX secolo, gli ingegneri costruirono una diga redirigendo il fiume nelle caverne sotterranee. I tunnel vennero illuminati e pavimentati con ciottoli per favorire il traffico automobilistico, e questa rete di strade sotterranee permette il passaggio anche al giorno d'oggi della maggior parte delle auto. È una delle caratteristiche principali della città.

La città ha giocato un ruolo di primo piano durante la guerra d'indipendenza del Messico visto che era la capitale dello Stato di Guanajuato da cui Miguel Hidalgo fece partire il movimento indipendentista. La statua di El Pipila e l'Alhóndiga de Granaditas ancora ricordano quel periodo.