בניית הכנסייה החלה בשנת 1572 בהוראתו של הגראנד מאסטר ז'אן דה לה קסייר (Jean de la Cassière), ותכנונה הופקד בידי האדריכל המקומי ג'רולאמו קסאר. היא מוקמה במרכזה של העיר המבוצרת ולטה, בירת ההוספיטלרים החדשה, שנבנתה לאחר עמידתם במצור הגדול על מלטה ב-1565. ב-1577 הסתיימה הבנייה, והכנסייה קושטה ועוטרה ביצירות אמנות עשירות. במחצית המאה ה-17 עוצב פנים הכנסייה מחדש בסגנון אדריכלות הבארוק, בפיקוחו של האמן בן קלבריה מתיה פרטי (Mattia Preti,‏ 1613-1699). השינויים החשובים ביותר בתקופה זו היו עיטורה מחדש של תקרת הספינה הראשית ב-18 סצנות מחייו של יוחנן המטביל, ועיטור הקירות הפנימיים של הספינה ושל קפלות הצד במיטב סגנון הבארוק. העמודים התומכים בתקרת הספינה הראשית צופו בשיש ירוק, ולמעשה, כל קירות הפנים, התקרה והרצפה של המבנה מכוסים בציורים, בשיש וביצירות אמנות. אחד המקורות החשובים ליצירות האמנות העשירות של הקתדרלה היה הנוהג לפיו כל גראנד מאסטר נבחר תרם לה יצירה כלשהי שהעידה, בין היתר, על עושרו ועל נדיבות לבו, והנציחה את זכרו.

ב-1798 נכנעו ההוספיטלרים לנפוליאון ועזבו את מלטה, ושנתיים לאחר מכן עבר האי לבעלות הבריטים. בצו של הוותיקן הוענק לכנסייה מעמד של קתדרלה במשותף בשנת 1816. במאה ה-19 הופקדה הקפלה של לשון צרפת (ראו להלן) בידיו של האמן המקומי ג'וזפה היזלר (Giuseppe Hyzler) מתנועת הנצרנים (תנועה אשר ביקשה להשיב את האמנות הדתית הנוצרית למקורותיה). זה הסיר את המזבח בקפלה, שינה חלק מיצירות האמנות בה וגרם נזק לאחרות. פעולותיו הופסקו בעקבות מחאה בשנת 1840. במלחמת העולם השנייה נפגעה הקתדרלה מההפצצות האוויריות של מדינות הציר על מלטה, אך אלה גרמו נזק בעיקר לאגפים המשניים ופחות לגוף הכנסייה עצמה. חדר המלבושים ומגדלי השעון נפגעו באופן קשה, ודלת הכניסה הראשית הועפה ממקומה. הנזקים תוקנו ותכולת המבנה ניצלה, במידה רבה בשל כך שהועברה מבעוד מועד למקום מבטחים. בשנת 2001 הוקמה "קרן קון-קתדרלת יוחנן הקדוש" (St John’s Co-Cathedral Foundation), המופקדת על ניהול הכנסייה והמוזיאון הצמוד לה, ועל שימורם.