Am Rande des jüdischen Friedhofes hatte Mordechai Maisel einige Klausen gegründet, die zwei Synagogen und eine Talmudschule des berühmten Rabbi Löw enthielten. 1689 brannte die gesamte Judenstadt ab und damit auch die Klausen. An ihrer Stelle wurde auf Betreiben des Synagogenvorstehers Shalom Kohen die Klausen-Synagoge in barockem Stil errichtet und 1694 fertiggestellt. Sie war die größte Synagoge Prags. Etwa zur gleichen Zeit entstanden auch drei weitere Synagogen, die Neue Synagoge, die Zigeunersynagoge und die Großenhof-Synagoge, die aber alle während der Assanierung der Judenstadt Ende des 19. Jahrhunderts abgerissen wurden. Somit vermittelt nur mehr die Klausen-Synagoge einen Eindruck der zur Barockzeit errichteten Gotteshäuser.

Die Klausen-Synagoge war eine der beiden Hauptsynagoge der Prager Judengemeinde und diente auch der Prager Beerdigungsbruderschaft. Mehrere bedeutende Vorstände der Prager Gemeinde wirkten an ihr als Rabbiner, so Eleasar Fleckeles, Samuel Kauder, Efraim Teweles und Baruch Jeitteles.

1883/84 wurde die Synagoge durch den Architekten Bedřich Münzberger renoviert und im Westen um ein Joch verlängert sowie mit einer breiten Frauenempore versehen. Die Glasfenster stammen ebenfalls aus dieser Zeit, wie auch die heutige Fassadengestaltung.

Während des Zweiten Weltkrieges wurde die Inneneinrichtung der Klausen-Synagoge zerstört und das Haus selbst diente als Lagerraum des Jüdischen Zentralmuseums, einer Sammlung von jüdischen Kultgegenständen durch die SS.

Bereits 1946 richteten hier Überlebende der Shoa eine Ausstellung über jüdische religiöse Feste und Gebräuche ein. Renovierungen fanden 1960, 1979 bis 1981 und zuletzt 1995/96 statt. 1984 änderte man die Ausstellung und zeigte hebräische Handschriften und alte Drucke, seit 1997 die neue Ausstellung über jüdische Festtage und Traditionen.