Va ser encarregada pel cardenal Hipòlit II d'Este (1509-1572), fill d'Alfons I d'Este i de Lucrècia Borja, i net del papa Alexandre VI. Havia estat nomenat governador de Tívoli pel papa Juli III, amb el regal de la vil·la preexistent, la qual va reconstruir completament seguint els dissenys de Pirro Ligorio, sota la direcció de l'arquitecte i enginyer ferrarès Alberto Galvani, que solia treballar molt sovint amb la família Este. El pintor cap de l'ambiciosa decoració interior va ser Livio Agresti de Forlì. Des del 1550 fins a la seva mort el 1572, quan la vil·la estava gairebé acabada, el cardenal d'Este va crear un edifici palatí envoltat d'uns esplèndids jardins amb terrasses en un estil manierista propi de l'última etapa del renaixement, que es va aprofitar plenament de l'espectacular vessant però que va requerir d'innovacions per portar aigua suficient per abastir totes les fonts, cascades i jocs d'aigua que els decoren. El resultat és una sèrie de grans vil·les del segle xvi amb estructures de jocs d'aigua situades als turons que envolten la campanya romana, com la vil·la Lante, la vil·la Farnesio de Caprarola i les vil·les Aldobrandini i Torlonia a Frascati. El seu planejament del jardí i els seus trets aquàtics es van imitar al llarg dels dos segles següents des de Portugal fins a Polònia.

Agafant la inspiració (i moltes estàtues i gran part del marbre usat en la construcció) de la propera vil·la Adriana, el palatí retir de l'emperador Hadrià, i revivint tècniques romanes d'enginyeria hidràulica per proporcionar aigua a una sèrie de fonts sense precedents, el cardenal va crear un elaborat jardí de fantasia la barreja d'elements arquitectònics i jocs d'aigua van tenir una enorme influència en el disseny europeu de paisatges.

Pirro Ligorio, responsable dels programes iconogràfics desenvolupats en les pintures al fresc de la vil·la, va ser també l'encarregat de dissenyar els jardins, amb l'assistència de Thomaso Chiruchi de Bolonya, considerat un dels millors enginyers hidràulics del segle XVI; Chiruchi havia treballat en les fonts de la vil·la Lante. En la vil·la d'Este va ajudar en els dissenys tècnics de les fonts un francès, Claude Venard, que era un expert creador d'orgues hidràulics.

El cardenal Alessandro d'Este va reparar i va ampliar els jardins el 1605. Al segle xviii, la vil·la i els seus jardins passen a la casa d'Habsburg després que Hèrcules III d'Este se'ls va llegar a la seva filla Maria Beatriu, casada amb el gran duc Ferran d'Habsburg. La vil·la i els seus jardins van ser descuidats. Els enginys hidràulics cauen en desús i moltes de les escultures decoratives encarregades per Hipòlit d'Este es dispersen per diferents llocs, quedant plasmada la sensació de decadència per diferents artistes com Carl Blechen i altres pintors. La situació va canviar durant la tinença del cardenal Gustav von Hohenlohe; el cardenal va tenir com a convidat a Franz Liszt, que va evocar el jardí en la seva obra Les Jeux d'Eaux à la Villa d'Este i va fer aquí un dels seus últims concerts. La vil·la d'Este va ser adquirida per l'Estat Italià després de la primera guerra mundial, restaurada i moblada de nou amb pintures dels magatzems de la Galeria Nacional de Roma. El volum de poemes de Jean Garrigue, titulat Un passeig per l'aigua en la vil·la d'Este (1959) continua una llarga tradició de poesia inspirada pels jardins. Kenneth Anger va filmar Eaux d'artifice entre els enginys hidràulics del jardí. Així que la vil·la ha estat aplaudida en poesia, pintura i música.

La vil·la acull el Museu Didàctic del Llibre Antic, un museu educatiu sobre l'estudi i la conservació de llibres antics.