Ivanovci, danes bolj znani kot vitezi malteškega viteškega reda, so se po padcu Rodosa leta 1522 nekaj let selili po Evropi, dokler niso leta 1530 od sicilskega kralja Karla V. dobili v trajen zakup malteško otočje in dele libijske obale. Še naprej so se bojevali proti muslimanom, predvsem proti berberskim piratom, in kmalu postali trn v peti osmanskega cesarstva. Sultan Sulejman Veličastni je zato leta 1565 nadnje poslal vojsko okrog 40.000 vojakov. Začelo se je obleganje, ki je trajalo od 18. maja do 11. septembra, ko so se oblegovalci umaknili.

Med obleganjem so se pokazale vse slabosti obrambnega sistema, zato so malteški vitezi sklenili, da zgradijo novo mesto in ga primerno utrdijo. Idejo sta podprla papež Pij V. in španski kralj Filip II. in obljubila tudi finančno pomoč. Temeljni kamen novega mesta je postavil veliki mojster malteškega viteškega reda Jean Valettski 28. marca 1566. Mesto je projektiral Francesco Lapparelli, načrte za najpomembnejše zgradbe (Sacra infermeria, sostolnica svetega Janeza, palača velikega mojstra in sedem rezidenc malteških vitezov) pa je naredil malteški vojaški arhitekt Girolamo Cassar. Gradbena dela so se začela marca 1566. Najprej so zgradili obzidje, obrambne bastijone in cerkev Gospe zmage, v naslednjih petnajstih letih pa še vse preostale pomembne zgradbe. Mesto so v čast velikemu mojstru imenovali Valletta.

Veliki mojster Jean Valettski je leta 1568 umrl. Nasledil ga je Pietro del Monte, ki je dela nadaljeval z nezmanjšano zagnanostjo in že leta 1571 so vitezi prenesli svoj sedež iz Vittoriose (Birguja) na južni obali Velikega pristanišča v novo prestolnico. Valletta je do konca 16. stoletja postala veliko mesto, kamor so se zaradi trgovine in varnosti začeli seliti prebivalci z obeh otokov, stara malteška prestolnica Mdina je izgubila velik del svojega prejšnjega sijaja.

Po odhodu malteških vitezov leta 1798 in kratkotrajni vladavini Francozov (1798–1800) so otočju zavladali Angleži. V tem času je Valletta dobila širša mestna vrata, nekaj novih in obnovljenih zgradb in mestno infrastrukturo. Med drugo svetovno vojno je bil med letalskimi napadi velik del mesta poškodovan in porušen. Mesto so po vojni obnovili in mu vrnili prvotni videz.