Сикстинская капелла была сооружена на месте, где до неё существовала «Большая капелла» (итал. Cappella Maggiore), в которой в эпоху Средневековья собирался папский двор, состоявший примерно из двухсот членов — кардиналов, представителей различных религиозных орденов и знатных семейств. Римский папа Сикст IV опасался военной угрозы со стороны флорентийской Синьории Медичи, с которой находился в напряжённых отношениях, и от Мехмеда II, чьи войска представляли потенциальную опасность для восточных берегов Италии. Поэтому он решил укрепить эту постройку. Проект создал архитектор Баччо Понтелли, а работы велись под руководством Джордже де Дольчи. Прямоугольное в плане помещение украшено настенными росписями, выполненными в 1481—1483 годах Сандро Боттичелли, Пинтуриккьо и другими мастерами по заказу Сикста IV. В 1508—1512 годах Микеланджело расписывал свод с люнетами и распалубками по заказу папы Юлия II. 31 октября 1512 года папа Юлий II отслужил торжественную вечерню в честь создания фресок на своде Сикстинской капеллы. 31 октября 2012 года, в тот же час, папа Бенедикт XVI повторил торжественную церемонию в честь 500-летнего юбилея этого события.

А в 1536—1541 годах Микеланджело расписывал алтарную стену — фреска «Страшный суд» создавалась по заказу папы Павла III. С конца XV века в Капелле проходят конклавы. Первым конклавом, прошедшим здесь, был конклав 1492 года, на котором избрали Александра VI. Капелла была освящена 15 августа 1483 года — в праздник Вознесения Богоматери.