Cosimo I. de’ Medici, Großherzog der Toskana, begann 1560 mit der Verwirklichung eines schon länger bestehenden Planes, die wichtigsten Ministerien und Ämter (die sogenannten uffici) in einem Bau zusammenzufassen. Für den Neubau wurde ein ganzes Stadtviertel abgerissen bzw. in den Neubau integriert, wie z. B. die romanische Kirche S. Piero Scheraggio und die Münzprägewerkstatt Zecca, in der die sogenannten Goldflorin hergestellt wurden. Vasari vereinheitlichte die Ansammlung alter und neuer Gebäude durch vorgesetzte Fassaden. Es entstand ein von zwei beinahe gleich aussehenden Fassaden flankierter Platz, der die Piazza della Signoria und das Ufer des Arno verbindet. Der Bau wurde nach Vasaris Tod 1574 von Bernardo Buontalenti und Alfonso Parigi bis ca. 1581 im Äußeren vollendet.

Francesco de’ Medici, Cosimos Nachfolger ab 1574, hatte schon 1570 einen Raum für seine Kunstsammlung im Palazzo Vecchio eingerichtet (das Stanzino del Principe). 1580–1588 wurde durch Buontalenti im Obergeschoss der Uffizien für die Präsentation weiterer Kunstwerke die berühmte Tribuna errichtet, ein Raum auf achteckigem Grundriss, der öffentlich zugänglich war. Parallel wurden im Bogengang des Obergeschosses, der galleria, die Sammlung der Kunstwerke in Familienbesitz präsentiert; durch einen über die Gasse angelegten Verbindungsgang war sie vom Palazzo Vecchio, dem Amtssitz des Herzogs, aus zu erreichen. Verschiedene antike Skulpturen aus Rom, die zunächst im Garten der Villa Medici ausgestellt worden waren, fanden in den Uffizien ihren endgültigen Platz. Das berühmteste Stück ist die sogenannte Mediceische Venus; sie wurde 1618 in der Villa des ehemaligen römischen Kaisers Hadrian aufgefunden; der Typus der Venus pudica, den sie verkörpert, wurde durch ein Original des Griechen Praxiteles im 4. vorchristlichen Jahrhundert angeregt und wirkte später eindringlich auf Künstler wie Pisano oder Botticelli.

Die Tribuna war 1704 durch venezianische Bilder, wie etwa von Tintoretto, Tizian, und Veronese, bereichert worden. Einen weiteren Schwerpunkt bildeten Gemälde von Holbein, van Dyck und niederländischen Malern des 17. Jahrhunderts, die besonders von Cosimo III. geschätzt wurden.[1]

Die Medici ergänzten ihre Kollektion mit weiteren Werken der Malerei und Bildhauerei bis 1737, als mit Gian Gastone de’ Medici der letzte ihrer Großherzöge starb. Anna Maria Luisa de’ Medici, die letzte Repräsentantin des Hauses Medici, vermachte das persönliche Eigentum der Medici der Stadt Florenz – unter der Bedingung, dass es niemals aus der Stadt entfernt würde. Nach ihrem Tod im Jahre 1743 wurden die Sammlungen öffentlich zugänglich gemacht. Im 18. Jahrhundert hatte die Sammlung der Uffizien durch Berichte von Besuchern auch über Florenz hinaus bereits Berühmtheit erlangt; Kunsthistoriker bezeichneten sie deshalb wiederholt als das erste Museum in Europa. Der Ursprung des Begriffs Galerie für eine Gemäldesammlung wird ebenfalls den Galerien der Uffizien zugeschrieben.

Im Erdgeschoss waren Werkstätten von Handwerkern untergebracht, die dem Fürstenhof der Medici zuarbeiteten. Zu ihnen zählte vor dem Ende des 17. Jahrhunderts auch der nach Florenz geworbene Instrumentenmacher Bartolomeo Cristofori, der um 1698 aus dem Cembalo durch die Entwicklung der Anschlagsmechanik den Urtypen des Klaviers entwickelte – die Uffizien sind somit die Geburtsstätte des Klaviers.[2]

Am 27. Mai 1993 explodierte in der Via dei Georgofili neben den Uffizien eine Autobombe der Cosa Nostra. Fünf Menschen starben, und ein großer Teil des Niobe-Saals samt der hier ausgestellten Skulpturen und den Deckenfresken wurde stark beschädigt.

Während Renovierungsarbeiten in den Uffizien im April 2021 fanden Arbeiter zwei lang vermisste Fresken aus dem späten 16. Jahrhundert. Eines wurde in einem Lagerraum im Westflügel unter der Wandverputzung freigelegt. Das Fresko ist ein Porträt von Cosimo II. de’ Medici in Lebensgröße. Als Maler wird ein Manierist aus der Schule von Bernardino Poccetti angenommen. Im gleichen Raum tauchte ein Wandgemälde von Cosimos Vater Ferdinando I. de’ Medici auf.[3]