Kaiserin Anna stiftete 1617 testamentarisch das Kapuzinerkloster und verfügte den Bau der Gruft. Ein Jahr später starb sie, im Jahr darauf ihr Mann, Kaiser Matthias. Begonnen wurde der Bau unter seinem Nachfolger Ferdinand II. (reg. 1619–1637) im Jahr 1622. Wegen des Dreißigjährigen Krieges dauerte der Bau elf Jahre. Nach der Fertigstellung im Jahr 1633 wurden die Särge von Anna und Matthias in die Gruft überführt. Seither wurde die Gruft insgesamt achtmal erweitert.

Kaiser Ferdinand III. (reg. 1637–1657) gab den ersten Auftrag zur Erweiterung der Gruft. Dadurch schuf er die Grundlage zum Ausbau der Kaisergruft zu einer Erbbegräbnisstätte der Familie Habsburg (später Habsburg-Lothringen). 1662 lieferte Steinmetzmeister Ambrosius Ferrethi aus Kaisersteinbruch für die Gründer- und die Leopoldsgruft Bodenplatten und Stiegenstufen aus glattpoliertem Kaiserstein.

In den Jahren 1908 / 1909 wurde anlässlich des 60-Jahre-Regierungsjubiläums von Kaiser Franz Joseph I. der nach ihm benannte Teil erweitert. Zu seiner Zeit erfolgte auch die Verkleidung des vom Kloster hinunterführenden Stiegenganges mit weißen Fliesen; 1909 wurde elektrisches Licht installiert. Die bisher letzte Erweiterung (Neue Gruft) fand von 1960 bis 1962 unter der Leitung von Karl Schwanzer im Auftrag der Republik Österreich statt.

Heute ist die Kaisergruft die letzte Ruhestätte für 12 Kaiser, 19 Kaiserinnen und viele weitere Mitglieder der Familie Habsburg bzw. Habsburg-Lothringen. Künstlerisch bemerkenswert sind die Karlsgruft (unter Kaiser Karl VI. vor 1720 angelegt, geplant von Johann Lucas von Hildebrandt) und die Maria-Theresien-Gruft (1758, geplant von Jean Nicolas Jadot de Ville-Issey und Nikolaus Pacassi), die in anmutigem Rokokostil gehalten ist. Der große, spätbarocke Doppelsarkophag für Maria Theresia und Kaiser Franz I. Stephan von Lothringen stammt von Balthasar Ferdinand Moll und wurde bereits zu ihren Lebzeiten angefertigt.

Als einzige Protestantin wurde hier 1829 Erzherzogin Henriette, Frau des erfolgreichen Feldherrn und Kaiserbruders Erzherzog Karl, bestattet, die bei ihrer Einheirat in die Familie Habsburg-Lothringen ihre Konfession nicht geändert hatte. Diese Bestattung musste von Kaiser Franz I. durchgesetzt werden.

Das Begräbnis von Otto Habsburg fand hier, als ältester Sohn des letzten Kaisers von Österreich und Königs von Ungarn der letzte Kronprinz der Donaumonarchie, und seiner 2010 gestorbenen Frau Regina von Sachsen-Meiningen am 16. Juli 2011 statt. Der letzte Kaiser selbst, Karl I. (reg. 1916–1918), ist nach wie vor an seinem letzten Exilort, Funchal auf Madeira, bestattet. Die letzte Kaiserin und Königin, Zita, wurde jedoch 1989 hier bestattet.

Die vorerst letzte Bestattung eines Mitglieds der Familie Habsburg-Lothringen erfolgte am 7. Oktober 2023 mit dem Begräbnis von Yolande de Ligne, die Ehefrau von Carl Ludwig Habsburg-Lothringen. Mit ihrer letzten Ruhestätte neben ihrem Mann in der Gruftkapelle sind damit jetzt raummäßig alle verfügbaren Plätze in der Kapuzinergruft belegt.[1]

Die Nachkommen des letzten österreichisch-ungarischen Herrscherpaares werden seit 1970 in der Loretokapelle des Klosters Muri im Aargau in der Schweiz, nicht weit weg von der Burg Habsburg, zur Ruhe gebettet. Das Kloster Muri war als Hauskloster im Mittelalter der Bestattungsort der Grafen von Habsburg, seit der Stiftung durch den Stammvater Radbot von Habsburg im Jahr 1027 bis 1260. Die Herzurnen des Kaiserpaares Karl und Zita werden ebenfalls hier aufbewahrt. Seither wurden aber zwei Söhne des Kaiserpaares sowie eine Ehefrau auf eigenen Wunsch in der Gruftkapelle der Wiener Kaisergruft bestattet.