Valletta blev grundlagt af Johanniterordenens stormester Jean Parisot de la Valette den 28. marts 1566, da ordenen, som længe havde regeret over øen, valgte at grundlægge en ny by på Scebberrashalvøen umiddelbart efter afslutningen af Maltas belejring med henblik på at styrke ordenens position på Malta. Byen blev tegnet af arkitekten Francesco Lapparelli, og mange vigtige bygninger blev bygget af Gerolamo Cassar.

Den 12. november 1592 åbnede det jesuiterdrevne Collegium Melitense, der fungerede frem til 1768, hvor Jesuiterordenen blev forvist fra øen. Johanniterne inddrog jesuiternes ejendom og stiftede Maltas Universitet den 22. november 1769. Universitetet har i dag hovedadresse i Tal-Qroqq, en del af Msida.

Næste byggeboom i Valletta indtrådte under britisk overhøjhed, hvor portene blev gjort bredere og en del bygninger nedrevet eller ombygget, og byen fik moderne faciliteter. Byen blev svært bombeskadet under anden verdenskrig – blandt andet ramtes byens operahus fra 1800-tallet. Byen har mange historiske cafeer, mødesteder, restauranter, banker, hoteller og regeringsbygninger. Der findes også offentlige haver med udsigt over byens havn.