Habitat des de temps prehistòrics, el territori d'Ostuni va ser ocupat al voltant del 1000 aC pels iapigis i els messapis. La ciutat va ser destruïda per Anníbal a la Segona Guerra Púnica, reconstruïda pels colons grecs i, en els segles següents, ocupada per Ostrogots i Longobards, Sarraïns, Sueus i Normands. El 1507 fou annexionat al ducat de Bari d'Isabel d'Aragó. Durant gairebé els dos segles de dominació espanyola, els ciutadans d'Ostuni varen intentar oposar-se a aquesta, fins que en 1799 es va proclamar ciutat lliure i republicana. El Congrés de Viena va marca el retorn dels Borbó, però també el ressorgiment de les seccions dels Carbonaris i després de Giovane Italia. El 26 d'agost de 1860, pocs dies després de la sortida de Garibaldi de Messina, Ostuni -la primera ciutat de la Pulla- va llevar l'escut d'armes borbònic i va aixecar la bandera italiana.