Początki zbiorów bibliotecznych sięgają XIV wieku, kiedy to po utworzeniu uniwersytetu w Pradze, w 1366 roku król czeski Karol I podarował uczelni kodeksy średniowieczne[1]. Od 1622 uniwersytet był prowadzony przez Jezuitów, którzy przenieśli uniwersytet wraz ze zbiorami bibliotecznymi do zbudowanego w 1556 roku gmachu Clementinum[1].

Pod koniec XVIII wieku zbiory uniwersytetu otrzymały z nadania cesarzowej Marii Teresy tytuł Królewsko-Cesarskiej Biblioteki Publicznej i Uniwersyteckiej (cz. c.k. Veřejná a univerzitní knihovna)[1]. Biblioteka posiadała od 1782 roku prawo do egzemplarza obowiązkowego. Początkowo tylko z terenu Pragi, w 1807 rozszerzono go do druków z całych Czech, a w 1935 roku z terenu Czechosłowacji[2].

W 1918 roku zbiory biblioteki objęto nadzorem państwowym nowo-powstałej Czechosłowacji. W 1924 utworzono bibliotekę słowiańską, która od 1929 roku znajduje się również w gmachu Clementium[1]. W 1935 roku biblioteka została przemianowana na Bibliotekę Narodową i Uniwersytecką, wprowadzono również obowiązek dla wydawców przekazywania zawsze jednego egzemplarza wydawanego dzieła do zbiorów biblioteki[1]. Po zajęciu Czechosłowacji przez III Rzeszę, biblioteka została przemianowana na Bibliotekę Miejską i Uniwersytecką (cz. Zemská a univerzitní knihovna)[1]. W 1958 roku bibliotekę połączono ze zbiorami innych praskich bibliotek w Narodową Bibliotekę Czechosłowacji. W roku 1990 biblioteka otrzymała swoją obecną nazwę[1].

W 2005 roku Biblioteka Narodowa Republiki Czeskiej otrzymała nagrodę Jikji dla instytucji i osób prywatnych, które najlepiej realizują cele projektu UNESCO Pamięć Świata[3].